В 1589 года московские митрополиты получили достоинство патриархов и признание автокефалии от патриарха Иеремии II и остальных восточных патриархов. Отличительной чертой управления Московской церкви по сравнению с прочими патриархатами было отсутствие при патриархе постоянно действующего собора епископов — синода, который к тому времени уже сложился как один из органов власти в прочих поместных церквях.

Часть православных митрополии Киевской, Галицкой и всея Руси, которая продолжала пребывать в юрисдикции Константинопольского патриархата на территории Речи Посполитой, в 1596 году заключила унию с папством (Брестская уния), что привело к возникновению Русской Униатской Церкви (лат. Ecclesia Ruthena unita) в Галиции, Волыни, Подолье, которые входили в состав Речи Посполитой, и последующему конфликту между униатами и православными.

Основным делом первого патриарха Московского Иова (1589—1605) стало проведение преобразований в Русской церкви, намеченных Соборным уложением 1589 года. Почти все епископские кафедры были повышены в ранге, открылось несколько новых. Иов возвёл в сан четырёх митрополитов, пятерых архиепископов (из шести) и одного епископа на семь задуманных новых епархий. Установил общецерковные праздники некоторым уже признанным ранее святым, канонизировал ряд новых. Патриарх способствовал распространению христианства среди инородцев Сибири, Казанского края, Корельской области. В Москве, в целях водворения большего благочиния в низшем духовенстве, было учреждено восемь поповских старост. За отказ признать Лжедмитрия I был лишён кафедры и сослан в Старицкий Успенский монастырь. Патриарший престол занял приспешник Лжедмитрия Игнатий (1605—1606), но сразу после убийства Лжедмитрия был лишён не только патриаршего, но и святительского сана.

Патриарх Гермоген (1606—1612) был выдающимся церковным писателем и проповедником, одним из образованнейших людей своего времени. При нём в Москве было возведено новое здание типографии, установлен печатный станок, печатались книги. Был активным противником поляков, за что заключён в Чудовом монастыре, где и умер от голода.

Наивысшей власти в государстве Московские патриархи достигли при патриархе Филарете (1619—1634), отце царя Михаила Федоровича. В 1625 году царь издал Несудимую грамоту, по которой суд над всеми церквами, монастырями и крестьянами на церковных и монастырских землях передавался патриарху, что превращало патриархат в status in statu. При Филарете было созвано два Земских собора (в 1619 и 1632 гг.), учреждена Тобольская и Сибирская архиепископия, открыта греческая школа для детей, развивалось книгопечатание. В 1619—1630 годах была подготовлена публикация капитального труда — 12-томника Миней месячных.

Преемником патриарха Филарета царь Михаил и его ближайшее окружение и сам Филарет, избравший своим преемником архимандрита Иоасафа, хотели бы видеть личность менее яркую и менее склонную к политической активности. При патриархе Иосифе (1642—1652) было издано наибольшее (по сравнению с прежними патриаршествами) количество книг — 38 наименований (некоторые из которых выдержали до восьми изданий). Патриарх поддерживал сближение с греческим Востоком и Киевом.

С 1653 года Патриархом Никоном при поддержке царя Алексея Михайловича, было осуществлено исправление богослужебных книг и иные меры по унификации московской богослужебной практики с греческой. Реформа Патриарха Никона не была принята частью Церкви, вследствие чего произошёл раскол, и возникло старообрядчество. Последние годы патриаршества Никона были ознаменованы конфликтом с царём, приведшим к низложению патриарха в декабре 1666 года.

В патриаршество Иоасафа II (1667—1672) состоялся Большой Московский собор русского и восточного духовенства, проклявший старообрядцев, одновременно предавая их государственному уголовному преследованию. Иоасаф II предпринимал усилия по проведению в жизнь запретов, введённых Московским собором. Вместе с тем, Иоасафу II не хватило энергии для выполнения ряда важнейших решений Московского двора: осталась нереализованной рекомендация собора о повсеместном заведении училищ (школ) и учреждении в России новых епархий (утверждена только одна — Белгородская). Борясь с проникновением западно-европейской манеры в русскую иконопись, патриарх стремился узаконить византийский стиль. При Иоасафе II были возобновлены проповеди в церквах. По его инициативе православные миссионеры действовали на Крайнем Севере (до островов Новой Земли), Дальнем Востоке (до Даурии). На Амуре, недалеко от границы с Цинской империей (Китаем).

Содержанием деятельности патриарха Иоакима (1674—1690) было отстаивание старины, престижа церкви и духовенства. Важнейшим событием его патриаршества было переподчинение в ноябре 1685 года Московскому патриархату части Киевской митрополии (Киевская и Черниговская епархии), которая до того находилась в юрисдикции Константинопольского престола: в 1686 году Константинопольский Патриарх Дионисий с согласия других Восточных Патриархов, послал грамоту, утверждающую постановление митрополита Гедеона Четвертинского во главе Киевской митрополии, присоединённой к Московскому Патриархату; преемники Гедеона Четвертинского, которого на Киевскую митрополию де-факто избрала казацкая старшина во главе с гетманом Самойловичем, канонически подчинялись Московскому Патриархату. Стойким противником переподчинения Киевской митрополии был принимавший деятельное участие в русских делах Иерусалимский Патриарх Досифей II (Нотара), считавший такое переподчинение противным канонам. За Гедеоном Четвертинским сохранялся титул «митрополит Киевский, Галицкий и всея Руси», а также право преднесения Креста в своей епархии и иные привилегии; Киевская кафедра была признана первоначальною в России. Вскоре, однако, митрополит Гедеон стал терять данные ему в Москве привилегии: в январе 1688 года у него было отнято право титуловаться митрополитом «всея Руси» (дозволено именоваться «митрополитом Киевским, Галицким и Малыя России»), а в июле из его ведения были изъяты Черниговская епархия и Киево-Печерская лавра, чем был подорван его престиж.

При Иоакиме неудачей закончилась повторная попытка царя на Соборе 1682 года увеличить количество епархий и ввести митрополичьи округа.

Другим важным событием в патриаршество Иоакима было учреждение Московской Славяно-Греко-Латинской академии в 1685 году.

Последний патриарх досинодального периода Адриан (1690—1700) был консерватором и противником реформ царя Петра I. При нём прошло два собора: в 1697 году и в 1698 году.